Workflow
Das Projekt hat einen stark ausgeprägten multidisziplinären Charakter und vereint ausgewiesene Expertise führender klinischer Einrichtungen (Intensivmedizin/Anästhesie) des Landes NRW, der Grundlagenwissenschaft (Immunologie, Proteinforschung) und Bioinformatik (Big Data Management). Das Vorhaben zeichnet sich durch eine sehr enge Interaktion zwischen einzelnen Projektpartnern aus, die enge Verzahnung und die Abstimmung der Arbeitsschritte zwischen den Projektpartnern ist gleichzeitig eine wichtige Voraussetzung für den erfolgreichen Projektverlauf. Das Projekt ist eingeteilt in 7 Arbeitspakete und der genaue Verlauf ist in Abbildung 1 skizziert. Zunächst werden alle beteiligten intensivmedizinischen Abteilungen durch die Firma Kairos vernetzt (AP1). Dabei werden aus den unterschiedlichen PDMS Systemen, in Absprache mit der KrankenhausIT, strukturierte Daten automatisiert in die zentrale Datenbank CentraXX per XML-Schnittstelle übernommen.
Dieser bis jetzt bundesweit erstmalig angewandte Ansatz zur Vernetzung mehrerer Abteilungen verschiedener Universitätskliniken und Krankenhausträger erlaubt den Aufbau eines großen gemeinsamen Patientenregisters von Patientinnen und Patienten mit schwerer Sepsis.
Zeitgleich erfolgt die standardisierte Abnahme und Aufbereitung von biologischem Material dieser registrierten Patientinnen und Patienten zu 4 prädefinierten Zeitpunkten innerhalb eines 30 Tage Beobachtungszeitraumes (AP2). Dabei wird die Abnahme und standardisierte Aufbereitung der Biomaterialien auf einen geschulten, genau definierten Personenbereich fixiert, um die Variabilität der Analyseergebnisse durch unterschiedliche Qualität der biologischen Proben zu verhindern. Die Proben werden zentral an der Ruhr-Universität Bochum im MPC archiviert. Das Probenmaterial wird im AP 2 vorselektioniert, um in Zusammenarbeit mit AP3 und 4 die gewünschten immunologischen Muster als Grundlage für den Sepsis-Bioassay und das Decision Support Modul zu erstellen. Um eine Ressourcen-effiziente und validierte Analyse von immunologischen Mustern zu ermöglichen, werden die Markeruntersuchungen in 2 Schritten durchgeführt. Dabei werden im ersten Schritt (AP3) aus einem großen Pool von Kandidatenmarkern diagnostische Marker bzw. Markersets an einem kleinen, in AP2 vorselektioniertem Patientenkollektiv identifiziert, die im zweiten Schritt (AP4) an einem breiten unselektionierten Patientenkollektiv verifiziert werden. Die Vorselektion hat den Vorteil, dass auswertbare Daten frühzeitig (nach ca. 6 Monaten) vorliegen werden und der Firma AYOXXA bereits zu Anfang des Projektes für die Entwicklung von Multiplex-ELISAs zur Verfügung gestellt werden können.
Damit werden zunächst 4 Gruppen, 1. überlebende und 2. verstorbene Patienten nach schwerer Sepsis sowie 3. Patienten mit einem starken inflammatorischen Reiz aber ohne Sepsis und 4. gesunde Probanden mit den bekannten Markern beschrieben. Auf diese Weise lassen sich vier Referenzgruppen definieren (vorselektionieren) an denen Initial die weiteren Analysen der APs3 und 4 durchgeführt werden können. Die Analysen werden mit 4 verschieden Ansätzen untersucht, um die immunologischen Muster aus den Seren und die zellulären Proteinmuster zu identifizieren (AP3) und zu verifizieren (AP4). Geplant ist, dass im AP3 für jede der 4 Patientengruppen zunächst ca. 20 Patienten analysiert werden. Als Methoden kommen zum einen Mikro-ELISA und Antikörper Chip-Array als auch label-freie Proteomics, Durchflusszytometrie und Genotypisierung zum Einsatz. Die erhobenen Daten fließen zum einen in das AP4 und zum anderen bereits frühzeitig zur biostatistischen Analyse in das AP5. Nach biostatistischer Analyse werden mögliche sensitive immunologischem Muster der Firma AYOXXA zur Entwicklung eines Multiplex-Bioassay zur Verfügung gestellt. In AP4 wird dann anschließend überprüft, ob sich die immunologischen Muster in den Seren nachweisen lassen, um die Sensitivität und Spezifität des Multiplex-Bioassay der Firma AYOXXA weiter zu steigern. In AP4 erfolgt eine enge Zusammenarbeit mit dem AP3, so dass die erstellten Proteinmuster verschiedener Zellpopulation aus AP3 mit den Untersuchungen des AP4 durch biostatistische Analysen in Assoziation gebracht werden können. Aufgrund der engen Verzahnung der einzelnen APs und das zentrale Sammeln aller gewonnen Daten aus den einzelnen APs kann eine umfangreiche biostatistische Analyse in AP5 erfolgen mit den Zielen:
Dieser bis jetzt bundesweit erstmalig angewandte Ansatz zur Vernetzung mehrerer Abteilungen verschiedener Universitätskliniken und Krankenhausträger erlaubt den Aufbau eines großen gemeinsamen Patientenregisters von Patientinnen und Patienten mit schwerer Sepsis.
Zeitgleich erfolgt die standardisierte Abnahme und Aufbereitung von biologischem Material dieser registrierten Patientinnen und Patienten zu 4 prädefinierten Zeitpunkten innerhalb eines 30 Tage Beobachtungszeitraumes (AP2). Dabei wird die Abnahme und standardisierte Aufbereitung der Biomaterialien auf einen geschulten, genau definierten Personenbereich fixiert, um die Variabilität der Analyseergebnisse durch unterschiedliche Qualität der biologischen Proben zu verhindern. Die Proben werden zentral an der Ruhr-Universität Bochum im MPC archiviert. Das Probenmaterial wird im AP 2 vorselektioniert, um in Zusammenarbeit mit AP3 und 4 die gewünschten immunologischen Muster als Grundlage für den Sepsis-Bioassay und das Decision Support Modul zu erstellen. Um eine Ressourcen-effiziente und validierte Analyse von immunologischen Mustern zu ermöglichen, werden die Markeruntersuchungen in 2 Schritten durchgeführt. Dabei werden im ersten Schritt (AP3) aus einem großen Pool von Kandidatenmarkern diagnostische Marker bzw. Markersets an einem kleinen, in AP2 vorselektioniertem Patientenkollektiv identifiziert, die im zweiten Schritt (AP4) an einem breiten unselektionierten Patientenkollektiv verifiziert werden. Die Vorselektion hat den Vorteil, dass auswertbare Daten frühzeitig (nach ca. 6 Monaten) vorliegen werden und der Firma AYOXXA bereits zu Anfang des Projektes für die Entwicklung von Multiplex-ELISAs zur Verfügung gestellt werden können.
Damit werden zunächst 4 Gruppen, 1. überlebende und 2. verstorbene Patienten nach schwerer Sepsis sowie 3. Patienten mit einem starken inflammatorischen Reiz aber ohne Sepsis und 4. gesunde Probanden mit den bekannten Markern beschrieben. Auf diese Weise lassen sich vier Referenzgruppen definieren (vorselektionieren) an denen Initial die weiteren Analysen der APs3 und 4 durchgeführt werden können. Die Analysen werden mit 4 verschieden Ansätzen untersucht, um die immunologischen Muster aus den Seren und die zellulären Proteinmuster zu identifizieren (AP3) und zu verifizieren (AP4). Geplant ist, dass im AP3 für jede der 4 Patientengruppen zunächst ca. 20 Patienten analysiert werden. Als Methoden kommen zum einen Mikro-ELISA und Antikörper Chip-Array als auch label-freie Proteomics, Durchflusszytometrie und Genotypisierung zum Einsatz. Die erhobenen Daten fließen zum einen in das AP4 und zum anderen bereits frühzeitig zur biostatistischen Analyse in das AP5. Nach biostatistischer Analyse werden mögliche sensitive immunologischem Muster der Firma AYOXXA zur Entwicklung eines Multiplex-Bioassay zur Verfügung gestellt. In AP4 wird dann anschließend überprüft, ob sich die immunologischen Muster in den Seren nachweisen lassen, um die Sensitivität und Spezifität des Multiplex-Bioassay der Firma AYOXXA weiter zu steigern. In AP4 erfolgt eine enge Zusammenarbeit mit dem AP3, so dass die erstellten Proteinmuster verschiedener Zellpopulation aus AP3 mit den Untersuchungen des AP4 durch biostatistische Analysen in Assoziation gebracht werden können. Aufgrund der engen Verzahnung der einzelnen APs und das zentrale Sammeln aller gewonnen Daten aus den einzelnen APs kann eine umfangreiche biostatistische Analyse in AP5 erfolgen mit den Zielen:
- Bündelung aller erhobenen Daten aus AP2 und AP3 und Definition eines Multi-Marker-Pane
- Etablierung spezieller Klassifikationsmodelle auf Basis der gebündelten Daten aus AP2 und AP3, den Daten zu den bisher nicht für Sepsis angewandten Markern aus AP3 und den klinischen Daten (Multi-Marker-Muster)
- Fortlaufende Erhebung von Daten als Grundlage und permanente Optimierung des Decision Support Moduls
- Nutzung der Multi-Marker-Muster als Basis für die Entwicklung eines klinisch anwendbaren Sepsis-Bioassay-Prototyps
Das alleinige Darstellen von immunologischen Mustern durch einen Multiplex Bioassay wäre bereits mittelfristig realisiert, würde aber auf viele weitere wichtige Informationen des Immunsystems verzichten und ggf. die Sensitivität und Spezifität des Assays deutlich reduzieren. Durch das Zusammenführen der Informationen aus den einzelnen APs soll ein klinisch anwendbarer Sepsis-Bioassay durch die Firma AYOXXA erstellt werden, der das immunologische Muster aus den Projektauswertungen realisiert und dessen Sensitivität und Spezifität durch Klassifikationsmodelle erweitert.